PROJETO

Durante os últimos anos, os avanços significativos no conhecimento dos aspectos moleculares nas interações planta-praga têm levado a uma expansão nas estratégias potenciais para aquisição de resistência transgênica em plantas. Todavia, a evolução de fatores de virulência pelos patógenos e de resistência a pesticidas pelos insetos representam constantes desafios à agricultura, o que tem impulsionado o interesse permanente da comunidade científica a se aprofundar cada vez mais no entendimento sobre as bases moleculares das interações entre plantas e seu meio biótico. O objetivo principal desta proposta é investigar os mecanismos moleculares relacionados com a resposta das plantas a estresses bióticos, dando ênfase às vias de regulação envolvidas na interação planta-patógeno e que levam à doença ou resistência. A referida proposta de pesquisa foi estruturada para atender a necessidade de avançarmos o nosso conhecimento sobre as bases moleculares e funcionais das interações entre plantas e pragas relevantes para a agricultura brasileira e de intensificarmos efetivas colaborações multidisciplinares e multi-institucionais que provavelmente contribuirão para a melhor adequação de procedimentos, permitindo a coleta de dados pertinentes da maneira mais eficiente possível.

Objetivos específicos:

1 - Identificar proteínas do hospedeiro (co-fatores ou reguladores) que interagem com as proteínas de movimento de geminivírus. A identificação de proteínas do hospedeiro que interagem com a proteína de movimento intracelular NSP (nuclear shutle protein) tem sido conduzida com sucesso em nosso laboratório, utilizando a varredura através do sistema do duplo híbrido. Estes estudos levaram a avanços científicos relevantes incluindo, por exemplo, a identificação de uma nova via de sinalização antiviral e a identificação pioneira de uma GTPase que facilita a translocação de NSP do núcleo para o citoplasma. A maior perspectiva será determinar a função celular de NIG (NSP-interacting GTPase) e examinar sua interação com a maquinaria de transporte núcleo-citoplasma da planta. No caso da proteína de movimento (MP) que facilita o transporte célula-a-célula do DNA viral, pretende-se identificar os fatores do hospedeiro que auxiliam e modulam a sua função de movimento.

2 - Caracterizar molecular e funcionalmente mecanismos de defesa inata da planta contra a infecção por geminivírus. Recentemente, a nossa equipe de pesquisadores identificou em tomate e em Arabidopsis uma nova camada de defesa inata de plantas que é alvo do fator de virulência NSP de geminivírus. Propõe-se, inicialmente, identificar os componentes desta via que tem como proteína inicial o receptor transmembrana NIK (NSP-interacting kinase) através de experimentos de interação proteína-proteína e por genética reversa no sistema modelo Arabidopsis. A ativação constitutiva desta via será obtida através de mutagênese sítio dirigida no receptor NIK para obter uma kinase constitutivamente ativa. Sob estas condições, poder-se-á analisar mudanças globais na expressão gênica associadas com a ativação desta via de sinalização que resulta na resposta de defesa da planta. Além disso, propõe-se caracterizar a proteína AV2 de diferentes espécies de geminivírus recentemente encontradas no Brasil e examinar se esta proteína funciona como supressora de silenciamento gênico.

3 – Examinar a biodiversidade de geminivírus no território brasileiro. Resultados recentes do nosso grupo demonstraram a existência de uma grande diversidade de geminivírus no Brasil. A partir de dados de seqüenciamento de várias novas espécies isoladas de tomateiros infectados, foram detectados eventos de recombinação no componente DNA-A viral. Uma vez que algumas das progênies virais derivadas dos eventos de recombinação exibem propriedades patogênicas diferentes dos seus predecessores, a nossa equipe de pesquisadores encontra-se em uma posição privilegiada para examinar a relevância das propriedades recombinogênicas na evolução e emergência de novos geminivírus no Brasil.

4 - Obter linhagens de tomates transgênicos resistentes a geminivírus e desenvolver vetores de silenciamento baseado em geminivírus. Recentemente, foi demonstrado por nossa equipe que o silenciamento de genes virais mediado por RNA de dupla fita é efetivo para conferir resistência a BGMV em feijoeiro trangênico. Baseado nestes resultados promissores, propõe-se explorar a mesma estratégia de RNA interferente para obter linhagens de tomateiros transgênicos resistentes a geminivírus. Além disso, pretende-se examinar se a manipulação da via antiviral mediada por NIK pode aumentar a tolerância a geminivírus e se esta via pode prevenir a infecção de outras viroses em tomateiros. Adicionalmente, estudos proteômicos e genômicos de diversas linhagens resistentes a geminivírus serão conduzidos com a finalidade de analisar o mecanismo de resistência natural. Será realizado também o mapeamento e o desenvolvimento de marcadores moleculares para os genes de resistência visando aplicação no melhoramento assistido e na determinação dos mecanismos de resistência envolvidos Como ferramenta molecular para silenciamento de genes em soja, vetores de silenciamento derivados do geminivírus SiMoV que infecta soja com alta eficiência serão desenvolvidos.

5 - Identificar proteínas secretadas pelas ferrugens que ativam respostas de defesa e seus alvos celulares: será efetuada a análise funcional de pressupostas proteínas secretadas pelas ferrugens P.psidii, H. vastatrix e P. pachyrhizi identificadas pela Rede Genoma de Minas Gerais. Diferentes métodos de expressão temporária de genes serão utilizados identificar proteínas capazes de desencadear a resposta de hipersenbilidade em genótipos ou cultivares resistentes. Os alvos dessas proteínas efetoras serão identificados por meio do sistema de duplo-híbrido de leveduras. A técnica de silenciamento gênico será utilizada para determinar a função fisiológica dos genes-alvo identificados. Os mecanismos moleculares envolvidos na especificidade de interação de pares específicos de genes R-AVR serão desvendados.

6 - Avaliar o equilíbrio entre as duas rotas alternativas derivadas da lipoxigenase e o seu papel na mediação das interações inseto-planta com o objetivo de estabelecer táticas de manejo contra insetos-pragas. Soja é o principal foco de atenção, e a lagarta da soja [Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae)] é a principal espécie de inseto sob investigação. Contudo, o esforço também será expandido para plantas de café, sementes de cereais e leguminosas, e de eucalipto utilizando pragas específicas a cada espécie. A resposta de inseto a estas rotas alternativas de defesa também será avaliada, bem como a avaliação do risco advindo da supressão genética da via das lipoxigenases em sementes de soja. A purificação de proteases do intestino da lagarta da soja e de seus simbiontes será realizada para posterior seqüenciamento utilizando MALDI-TOF. O centro ativo das enzimas será mapeado usando peptídeos sintéticos. Inibidores sintéticos de protease serão modelados para a inibição de proteases das espécies de pragas visadas, o que minimizaria seus impactos não-visados.

O trabalho proposto é altamente relevante para o avanço do melhoramento de plantas e a sustentabilidade da agricultura brasileira. Particularmente no Brasil, os geminivírus infectando tomateiros têm emergido como patógenos economicamente relevantes, limitando consideravelmente a produtividade desta importante cultura. Similarmente, fungos que causam ferrugem e insetos fitofágos têm causado significativas perdas na cultura da soja. O desenvolvimento desse projeto levará à identificação e clonagem de genes responsivos a insetos e a fungos em soja. Além disto, proteínas chaves na interação entre geminivírus e seus hospedeiros serão identificadas originando estratégias moleculares para obtenção de plantas resistentes a geminivírus. Do ponto de vista biotecnológico, o isolamento e a caracterização de genes que governam as respostas aos estresses bióticos constituem pré-requisitos para a compreensão e modificação dos processos adaptativos em plantas.

Do ponto de vista científico, os resultados de nosso programa contribuirão para aumentar nosso conhecimento com relação aos mecanismos básicos sobre as vias de sinalização de defesa conservadas e únicas encontradas nas plantas superiores. Além disso, devido ao fato de os geminivírus utilizarem a maquinaria de transporte intra e intercelular das células vegetais, a abordagem do programa, baseada na identificação de interações moleculares, encerra o potencial para o estabelecimento de uma estrutura que permita a elucidação da maquinaria de transporte núcleo-citoplasmático de células vegetais, além de resultar em contribuições significativas para o entendimento da regulação do plasmodesma durante o transporte célula-célula de macromoléculas.